Микоплазма (в широком ассортименте видов: от U. urealyticum до M. gallisepticum) упорно растет в наших клеточных культурах ( Ловим ее и в пролеченых линиях, и в "чистых" линиях из отечественных банков... и вообще, везде, куда глядим достаточно пристально. Быть может, это исключительно наша головная боль, но более вероятно, что мало кто уделяет этому достаточно внимания.
Мысль:
Если есть люди, для которых это актуально (и у которых нет денег на кучу качественных антимикоплазменных китов), то может поможем друг другу информацией?
Отпишите, плз, буду благодарен.

Америку не открою, но вам НИКОДА от нее не избавиться!!! Либо надо лечиться всему институту, доставать новые чистые клетки, ламинары и инкубаторы. Есть самое простое средство - ципрофлоксацин из аптеки, но лучше сухой купить в ICN и сделать сток (концентрацию на вскидку не вспомню, если интересно, напишу еще). Им если помните даже Буш пытался сибирскую язву в Вашингтоне лечить. Культивировать можно все клетки для профилактики недели две уж точно, но полного излечения не будет по-моему никогда, но кажется эффект есть, если красить хехстом, зараза все-таки "уходит", но потом появляется снова и так по кругу. Гоните прочь всех заразных из вашей культуральной комнаты.

Уважаемый Berejnov!
Не все так страшно!
Мой длительный опыт борьбы с микоплазмой (20 лет)однажды заставил меня задуматься: нужна ли мне АБСОЛЮТНО чистая культура. Ну вылечила ее, а потом попалась банка контаминированной сыворотки и снова здорово. Резюме: для меня (не знаю как для Вас) главное, чтобы клетки хорошо росли, результаты экспериментов воспроизводились, крупные колонии, уже видимые в фазовом контрасте, не раздражали. Для этого нужно разок отлечить клеточки и заморозить stok. Я пользуюсь BM-cyclin, некоторые также хвалят ICN-овский препарат. Ципрофлоксацин тоже, говорят, неплох. Неплохо помогает сдержать заразу линкомицин (постоянно вести с ним культуру в концентрации 100мкг/мл, это если нет возможности выбросить клетки и разморозить новые; 40%-ный раствор можно купить в аптеке). И поверьте старому культуральщику: в настоящее время при наличии надежных ламинаров основной источник микоплазмы сыворотка и только сыворотка! Микоплазма не летает, это клеточный паразит. Чтобы человек заразил культуру, нужно, по крайней мере, наплевать в матрас. Можно начихать. Но зацикливаться на микоплазме не стоит; изучать с какой скоростью растет...ну знаете, может стоит вспомнить, по какой все-таки тематике Вы работаете? Если нужна консультвция, пишите на мыло - я на сайт заглядываю нерегулярно

летает еще как летает особенно если в ламинаре стоит вауумный насос для отбора среду а нерадивые китайцы не снимают пользованых носиков.
Да ICN-ский препарат хорошо лечит на ранних скажем так стадиях, когда не сильно запущено.

Микоплазма влияет на целый спектр клеточных процессов, поэтому изучать зараженные клетки как модель нормальных я бы не советовал. Вылечить микоплазму, действительно, крайне трудно, и только на ранних стадиях (когда Хекстом еще не очень видно, а видно только PCR ). Если есть возможность, выбросите все зараженные клетки. Если это невозможно, хотя бы используйте для зараженных отельный ламинар и инкубатор (если нет второго инкубатора, хотя бы храните зараженные клетки на нижней полке, отдельно от остальных).

Спасибо за советы.
Я, правда немного не понял про Хехста и что есть Айсиэновский препарат (ципрофлоксацин?) и БМ-циклин, ну на ничего, прочитаю на праздниках.
Ципрофлоксацином мы их и давили, только вот уреаплазма к нему резистентна - приходится добавлять энрофлоксацин, хотя может стоило повышать концентрацию до 8 мг/мл... Проблема то в том, что паразит снова появляется по прошествию 10 - 15 пассажей и откуда он - не ясно, то ли перезаражаем, то ли рецидивирует старый.
Махнуть рукой на эту гнусь вроде как не получается - линии предполагается трансфецировать и вводить людям в составе вакцин. Да и вообще: зараженная клетка нормальной - лёпус эст. То начинает экспрессировать не пойми что, то дохнет во время заморозки.
Ладно, попробуем линкомицин.

Если вы собираетесь вводить людям эти линии, то клетки с микоплазмой нужно не лечить, а _выбрасывать_. Мне кажется, что Вам нужно сосредоточиться не на излечивании клеток, а на том, как элиминировать все возможные источники заражения, наладить систему контроля (для Ваших целей - обязательно PCR!) и начать работать без микоплазмы. Поверьте, что если Вы сможете полностью "очиститься" от микоплазмы в лаборатории и отбраковывать зараженные культуры, приходящие извне, то цель вполне достижима. И она стоит средств. В отличие от линкомицина.

"Махнуть рукой на эту гнусь вроде как не получается - линии предполагается трансфецировать и вводить людям в составе вакцин."
Не кисло однако собираются вакцинные линиии получать, а сами по уши в микоплазме!!! Это по нашему по Российски...
" Микоплазма (в широком ассортименте видов: от У. уреалытицум до М. галлисептицум)" такие обширные познания о том чем контаминированны культуры и в тоже время "детекции зверей по поведению культуры и некоторые другие соображения. " что-то на уровне шаманства.
Хотелось бы узнать какие интересно вакцины собирается данный коллектив получать чтоб не попасть случайно под их раздачу.

Если вдуматься, вообще получается кошмар: вот Вы подобрали путем "обширных наработок" некие условия, в которых микоплазма не дает о себе знать. Но раз Вы PCR-ом не смотрите, то, значит, латентную форму не увидите. Потом Вы эту "чистую" линию засаживаете в человека, а там совсем другие условия. Тут-то она и просыпается.

Страусиная политика какая-то, честное слово.

"Не все так страшно!
Мой длительный опыт борьбы с микоплазмой (20 лет)однажды заставил меня задуматься: нужна ли мне АБСОЛЮТНО чистая культура
главное, чтобы клетки хорошо росли, результаты экспериментов воспроизводились, крупные колонии, уже видимые в фазовом контрасте, не раздражали."
Вообщем главное что-бы костюмчик сидел а остальное по барабану....

[Текст переведён с транслита]

И белые тапки...

[Текст переведён с транслита]

"линии предполагается трансфецировать и вводить людям в составе вакцин"
Вы меня заинтриговали до крайности: сначала речь идет об опухолевых линиях (К562, Jurkat), а потом о введении человеку...
Это кому же и что Вы собираетесь вводить и кто Вам это позволит? И как Вам удается работать так, что "паразит снова появляется по прошествию 10 - 15 пассажей и откуда он - не ясно"? Да ясно откуда - из сыворотки! Если только у Вас в лаборатории нет вышеописанных идиотов, которые "не снимают пользованых носиков".
Теперь об антибиотиках. Я пользуюсь BM-cyclin'ом. Закупили мы его лет 10 назад, растарировали и храним на -70. Продает его Берингер Манхейм, купить сейчас можно, если не ошибаюсь через Химмед. Через 2 недели свои клетки не узнаете. Причем эффективно лечит даже сильно контаминированные культуры. PCRом, правда, не тестировали, для наших целей это не было нужно. Но никаких фокусов типа "То начинает экспрессировать не пойми что, то дохнет во время заморозки" больше не было. Кстати, как же Вы определяете, что клетки у Вас контаминированы микоплазмой, если не анализируете их с помощью PCR и "немного не понял про Хехста"? Как же Вы ее "ловите"?
Что-то я совсем расчувствовалась - видимо, молодость вспомнила, когда подсаживала к своим клеткам мышиные макрофаги, чтобы они эту пакость объели. Пишите на мыло galinapo@mail.ru, откапаю ВМ-циклинчика.

"линии предполагается трансфецировать и вводить людям в составе вакцин"
Вы меня заинтриговали до крайности: сначала речь идет об опухолевых линиях (К562, Jurkat), а потом о введении человеку... Это кому же и что Вы собираетесь вводить и кто Вам это позволит?
И как Вам удается работать так, что "паразит снова появляется по прошествию 10 - 15 пассажей и откуда он - не ясно"? Да ясно откуда - из сыворотки! Если только у Вас в лаборатории нет вышеописанных идиотов, которые "не снимают пользованых носиков".
Теперь об антибиотиках. Я пользуюсь BM-cyclin'ом. Закупили мы его лет 10 назад, растарировали и храним на -70. Продает его Берингер Манхейм, купить сейчас можно, если не ошибаюсь через Химмед. Через 2 недели свои клетки не узнаете. Причем эффективно лечит даже сильно контаминированные культуры. PCRом, правда, не тестировали, для наших целей это не было нужно. Но никаких фокусов типа "То начинает экспрессировать не пойми что, то дохнет во время заморозки" больше не было. Кстати, как же Вы определяете, что клетки у Вас контаминированы микоплазмой, если не анализируете их с помощью PCR и "немного не понял про Хехста"? Как же Вы ее "ловите"?
Что-то я совсем расчувствовалась - видимо, молодость вспомнила, когда подсаживала к своим клеткам мышиные макрофаги, чтобы они эту пакость объели. Пишите на мыло galinapo@mail.ru, откапаю ВМ-циклинчика.

to galina. Почему вы уверены, что микоплазма ползет из сыворотки? По-моему это не основная причина, мы использум скринированную на микоплазму австрийскую сыворотку здесь дома, и известно, что ей пользуется годами целый немецкий институт и клетки у них чисты как стеклышко (до сих пор удивляюсь такому, сама проверяла). Так что дело здесь отнюдь не в сыворотке, а, повторюсь, в неизлечимо больных клетках, грязных инкубаторах и ламинарах. Не меняя вышеперечисленное, микоплазму можно только задавить до какого-то минимального уровня и затем не позволять клеткам доводить себя до вспышек этой заразы (периодически культивируя их к примеру на антибиотиках). И если в лаборатории появляются чистые клетки, ни в коем случае нельзя работать с ними в старых ламинарах и инкубаторах с другими сомнительными клетками, но можно с той же сывороткой, но из отдельной бутылки...

То что сыворотка даже буржуйская может быть контаминирована микоплазмой это не частый но факт сами тут месяца 3-4 назад поймали виз Сигмовской сыворотки правда всего осна банка была с заразой. Но главная причина согласен с Анной это изначально очень контаминированный сток и все остальное.
В данный момент меня больше интересует -"линии предполагается трансфецировать и вводить людям в составе вакцин." Какие вакцины где и когда....

[Текст переведён с транслита]

Писала раньше, но были какие то глюки с компом, сообщение не туда попадало!
Дорогие все! (крик отчаяния!) Микоплазма ползет из пипеток, банок, крышек, фильтров в ламинарах и из всего того, от чего очень трудно избавиться
Если в вашем ламинаре кто то работает с зараженной линией, даже при всех ухищениях через пару недель вы получите микоплазму в вашей чистой. Выход один - выбрасывать все, 3 дня дезинфекции ВСЕГО! Очень жесткой, со сменой всех фильтров итд итп
Мы имеем очень большие проблемы с нашими линиями, елси к нам попадает микоплазма, поетому мы не разрешаем никому постороннему заходить в нашу культуральную, никогда не пускаем ничйи клетки ни в наши ламинары, ни в наши инкубаторы, ни на наши центрифуги.
Лечить бесполезно, она все равно остается, и только потом заражает то, что вам кажется чистым
Согласна, правда, что есть линнии (клеток и исследований), которым микоплазма не мешает, но это очень индивидуально
все, что касается клеточного цикла - мешает , и очень.
Ну все, высказалась...

to Manja. Эх, М.аня, как я тебя понимаю, но мы до сих пор воем от микоплазмы, так как от безысходности не можем все выбросить и заменить, я ее "собаку" глазом вижу и мирюсь, подлечивая клетки... Люди, если вы дошли до того, что не можете работать с микоплазменными клетками, потому что они не растут или меняют свои свойства, придется либо забыть о работе вообще, либо потратить все имеющиеся деньги на новое оборудование и отдельную комнату, а затем соблюдать рекомендации Мани. Делайте это!
PS низкий поклон душевному городу Лиону

Счас предложат еще спалить институт и построить новый... Полностью уничтожить микоплазму не получится (что такое клетки чисты как стеклышко? 1 микоплазма на 1000 клеток? На 100000? Чем проверите?). Можно получить чистый клон, но сколько он продержится чистым? Действительно, источник загрязнения - чаще всего зараженные клетки, а не сыворотка. Сыворотку достаточно инактивировать. Некоторые, правда, берут поллитровку из холодильника, суют в баню и через час (как написано) вынимают - а она и до 40С не нагрелась. Тем не менее, если работать чисто, можно свести заражение к минимуму, не обнаруживаемому ПЦР. Кроме стандартных мер (чистота, УФ, перчатки, спирту и хлороксу не жалеть) надо:
1. Все вновь полученные линии проверять, если заражение сильное - в хлорокс. Если видимого заражения нет, проводить через BM-cyclin или подобное, затем замораживать не менее 10 ампул и не поддерживать линию дольше необходимого минимума пассажей. Для каждого эксперимента поднимать новую ампулу.
2. Хранить клетки в парах азота, а не в азоте. На такое хранилище стоит и потратиться.
И все у нас получится...

Где-то читал, что микоплазма не выдерживает высушивания, и поэтому распространяться может только капельным путём или через неснятые носики. В ламинаре поток воздуха достаточно мощный, то есть если если дезинфектировать поверхность ламинара после работы и потом на полчаса оставить его под УФ всё должно высохнуть, включая капельки на фильтрах. То же самое касается и остального, т.е. непонятно, зачем ЖЁСТКАЯ дезинфекция.

Согласен, что для cell cycle studies культуры должны быть без микоплазмы. Однако многие из этих экспериментов длительные, а микоплазму можно подхватить в начале, добавив что-то нестерильное, и через несколько дней она и разрастётся. Вы не пробовали перед началом экспериментов сажать клетки на ципрофлоксатин, для профилактики?


Utch,

В чём смысл хранения клеток в ПАРАХ азота, а не в жидком азоте?

to Utcn. Клетки чисты как стеклышко, значит проверяем ПЦР, мне кажется достаточно, я не права? А ДАПИ в рутине каждый день, грубо конечно, но хоть что-то. А что значит "заражение сильное - в хлорокс", клетки на выброс? А если они уникальные, но зараженные по максимуму, хотя и не видно явных изменений в клет. цикле и нет возможности получить новые? И в этом случае для нас остается постоянная профилактика на ципрофлоксацине с размораживанием новых ампул малой контаминированности. А практика с новой комнатой и оборудованием работает (про институт простите загнули), так было сделано специально для stem cells, молимся на нее и даже на порог никого не пускаем. Работает...

ПЦР, даже нестед, не гарантия. Если берете 100 нг ДНК (1000 клеток) в реакцию, 1 шт. микоплазмы надежно не обнаружить. Теперь представим, что микоплазма делится всего вдвое быстрее клеток, и прикинем, через сколько делений она перезаразит все. Сильно зараженные клетки - можно конечно лечить, но на свой страх. Я бы не стал - слишком опасно.

Насчет паров азота - в певую очередь это исключает контаминацию через азот. Мне не приходилось встречать полностью гереметичных ампул для заморозки - азот частенько проникает внутрь. А в нем может плавать что угодно, в том числе и микоплазма из других ампул. Системы для хранения в парах недешевы, но стоят своих денег, ИМХО. Пример тут: http://www.tissue-cell-culture.com/docs/Ot...ge-Systems.html

))
"Распни, распни его!!! Разносчики заразы!!! ОНИ ХОТЯТ НАС ВСЕХ ЗАРАЗИТЬ МИКОПЛАЗМОЙ ЧЕРЕЗ ВАКЦИНЫ!!! Позор!!!" Гы... ) Понял, поясняю:
1. Речь идет о создании АУТОЛОГИЧНЫХ вакцин для онкологических больных, а также о том, что микоплазма обнаруживается при ВХОДНОМ контроле контаминации в ПЦР (делает "Лагис" и, редко, "Амплисенс"). Незараженных МП больных так и не нашлось - они же по нескольку лет в медучереждениях проводят, а там этого добра навалом всегда было.
2. Когда мы это обнаружили, то проверили все линии, которые были в ходу и... нашли ее везде. Во всех, без исключения культурах. Самое поганое, что нам требовалась заведомо чистая линия (ну чтобы поймать в какой из моментов она заразится) так вот: такой линии не нашлось. Получили 2 линии из питерского банка к.к. (НИИ цитологии) - уреаплазма; взяли пролеченные китом клетки из дружественной "лаборатории Х" - М. пневмониа, а сколько нам давали линий просто так, со словами "ну тут ее точно нет!"...
3. Поскольку линии поставленные от больных особенно не по культивируешь, то я не придумал ничего лучше, чем поискать методику деконтаминации на к562, а потом попытаться воспроизвести ее на наших линиях. Насколько подойдет метода - вопрос не ясный.
4. Шаманства или антимикоплазменной экстрасенсорики, увы, пока не освоил - гуру все никак не найду. И, коль скоро, микробиологических методов у нас в лабе никто не знал, то единственное чем мы пользовались для диагностики это та самая ПЦР в вышеупомянутых конторах.
5. Слить культуру - низя; вводить ее зараженной - низя; что, простите делать, кроме как лечить???
Уф...

1. Как то странно что клетки он ВСЕХ пациентов оказались заражены микоплазмой прямо готовая тема для диссера о связи онкозаболеваний и микоплазмоза.
2. Есть такая контора ATCC называется не думаю что у Вас не нашлось 500у.е. чтоб заказать культуры там.

To Utcn
> Насчет паров азота - в певую очередь это исключает контаминацию через азот. Мне не приходилось встречать полностью гереметичных ампул для заморозки - азот частенько проникает внутрь. А в нем может плавать что угодно, в том числе и микоплазма из других ампул. Системы для хранения в парах недешевы, но стоят своих денег, ИМХО.

Красиво и, возможно, даже правда. Не понятно только почему микоплазма из ампулы в ампулу перелезает с азотом, а клетки нет. То есть я не сталкивался с тем, что после размораживания обнаруживается контаминация клеточной линией из соседней ампулы. Конечно такую контаминацию не всегда просто увидеть, но хоть бы несколько случаев, так ведь нет. Более того, в моей практике был случай, когда деятель заморозил клетки зараженные какой-то грибной гадостью, которая после разморозки выползала за ночь культивирования, так и то с соседними ампулами ничего не случилось.

Ya kak to tozhe v kontaminaciyu cherez zhidkij azot ne veryu. Hotya kartina misticheskaya mikoplazmy l'dinki begayut ot ampuly k ampule.

Legionu: beri bol'she v Rossiyu my tol'ko za 800 iz ATCC smogli dostat', i to po deshevke.

"То есть я не сталкивался с тем, что после размораживания обнаруживается контаминация клеточной линией из соседней ампулы." Бывает и такое, нечасто правда. На моей памяти люди растили CHO, а вырастили человечьи клетки. Просто клетки при заморозке дохнут на 90%, а микоплазма нет.

> Бывает и такое, нечасто правда. На моей памяти люди растили CHO, а вырастили человечьи клетки.
И доказали, что они в азоте из ампулы в ампулу перепрыгнули?

Просто клетки при заморозке дохнут на 90%,.
Ну это смотря какие и как замораживать,...

Я в общем то не собираюсь говорить, что вероятность указанного вами способа контаминации клеток микоплазмой равна нулю, но считаю, что это бесконечно малая величина по сравнению с вероятностями других путей. Например грязной работы.

Кстати, сколько тут людей, кто клетки вовсе без антибиотиков ведет?

У людей у которых 90% дохнет при заморозке и не такое может быть. [Текст переведён с транслита]

АЕ
1. О грязной работе речь не идет - если бросать пипетки из флакона на стол, лучше сразу заняться чем-нибудь попроще.
2. Не доказали (да и как это докажешь), но других объяснений не придумали. Контаминация клетками, конечно, маловероятна, а вот микоплазмой...
3. Дохнут естественно по-разному, но если отдельные клетки, да плавают в азоте, вероятность сдохнуть ИМХО выше.
4. Ну у нас ведется все без антибиотиков, добавляем только при больших наростах, типа 10х9.

А может ли микоплазма передаваться от больных клеток человеку?

А когда красишь клетки DAPI, то можно увидеть микоплазму???? Ну, вот если видно, такой какой то мусор мелкий в цитоплазме, а еще такой ореольчик по клеточной мембране. Или только Хехст может детектировать эту чудь. Просто хочу понять, сразу заказывать билет и валить отсюда, или есть шанс выйти из пике. Проблема простая- трансфецирую клетки и получаю высокую токсичность с липофектамином 2000 и некоторыми липосомами А Сурового. Еще клетки стали медленно расти, иногда наблюдаю некое клонирование культуры- рассаживаю и они сволочи опять клонируются. Так пациент скорее мертв или еще теплится жизнь??? Достать новые клетки- не проблема, и из ATCC и из EMF из нокаутных мышей, другое дело, что уберечь их от заразы в Институте, где работает туча народа... Неужели билет... :-))

угу в один конец...

а по поводу окраски DAPI это она родимая и есть

[Текст переведён с транслита]