К растворам, использующимся при работе с культурой клеток относятся:

• питательные среды,
• сыворотка,
• индикаторы,
• антибиотики,
• трипсин и т.д.

Питательные среды содержат L-изомеры аминокислот, неорганические соли, витамины и другие компоненты (сахара, кислоты, дрожжевой экстракт и т.д.).

Перед использованием питательных сред в них добавляется определенное количество (чаще всего 5-10%) сыворотки (эмбриональной, крупного рогатого скота и т.д.).

Нередко в состав питательных сред вводят различные ростовые факторы (эпидермальные ростовые факторы - EGF, факторы роста фибробластов - FGF, эритропоэтин, интерлейкин-3 - IL-3).

Ростовые факторы - это высокоспецифичные белки сыворотки; большинство из них вносится в питательные среды в очень незначительных количествах: 10^-9 - 10^-11М. Функцией ростовых факторов является прежде всего стимуляция пролиферации клеток и клеточного метаболизма.

Примерами богатых многокомпонентных сред могут служить: среда 199, среда DМЕМ. Эти среды мы и будем использовать.

В качестве примера культуры клеток нами будет использоваться культура СПЭВ. Линия получена в 1959 г. К.С. Куликовой в Московском НИИ вирусных препаратов.

Культура представлена эпителиоподобными клетками почки эмбриона свиньи. Сплошной монослой образуется через 3-4 дня после посева и не деградирует в течение 4-х суток. Пассирование проводят на 2-е сутки после образования монослоя. Концентрация клеток при пересеве должна составлять не менее 450 тыс. кл./мл.

Для данной клеточной культуры существует ряд оптимальных композиций питательных сред.

Приведем пропись одной из них:
 

Компонент питательной среды Содержание, % Среда DМЕМ Гидролизат лакт-альбумина (ГЛА) Среда 199 Глутамин Сыворотка эмбриональная Нистатин 40 40 10 1-2 8-9 0,05 Антибиотики (на 100 мл): Пенициллин 1000000 ед. 20 мкг Гентамицин 1000 ед. 25 мкл

 

Питательные среды готовятся переливанием в один флакон всех составных частей в направлении уменьшения объема (DМЕМ -> ГЛА -> среда 199 -> и т. д.).

Некоторые компоненты составных питательных сред не могут быть стерилизованы в автоклаве или сухожаровом шкафу.
Их необходимо подвергнуть стерилизации фильтрованием.

Подготовка фильтра к работе.

Приспособление для фильтрации состоит из пластикового или металлического фильтродержателя (см. рисунок) и собственно фильтра.
 

Фильтр вставляют в фильтродержатель,	собирают все части фильтродержателя, помещают собранное приспособление в стеклянный стакан, закрывают двумя слоями фольги и автоклавируют. Ваш фильтр готов к работе.
Горлышки всех стерильных флаконов и бутылей закрыты двумя слоями фольги. Перед тем как начать фильтрование в приготовленный флакон, надо осторожно снять верхний слой фольги, нижний слой обработать горящей ватой, смоченной в спирте.
	Затем стерильный фильтродержатель с фильтром извлекается из стеклянного стакана. Носиком нижней части фильтродержателя протыкается обожженный слой фольги. В отверстие крышки фильтродержателя вставляется шприц с раствором, который надо стерилизовать. При плавном нажатии на поршень шприца (1), вся жидкость скапливается в полости фильтродержателя (2) и попадает затем в стерильный флакон (3).
Фильтродержатель снимается с фольги, которая еще раз обжигается горящей ватой. Флакон со стерильным раствором закрывается пробкой над горелкой.	При дальнейшем использовании стерильных растворов, перед открыванием посуды, резиновую пробку следует обработать горящей ватой, смоченной в спирте, по границе контакта пробки и стекла.

Это правило должно неукоснительно соблюдаться при работе с любой cтерильной посудой.

Индикаторы.

Обратите внимание на то, что среда имеет красный цвет. Это достигается добавлением в среду индикатора Phenol Red.
 

- А с какой целью? - Индикаторы в питательные среды добавляются для того, чтобы контролировать кислотность среды в любой момент времени. Клетки в процессе роста подкисляют среду, и индикатор приобретает желто-оранжевое окрашивание. Посмотрите, как свежая, вновь налитая питательная среда (2) отличается по цвету от среды, в которой культивировались клетки (1).

Обратите внимание на прозрачность среды. Замутнение среды или изменение цвета индикатора на ярко-желтый или красно-синий (малиновый) может свидетельствовать о заражении среды и культуры клеток микроорганизмами.

Антибиотики.

Мы используем такие антибиотики как пенициллин, гентамицин (антибактериальные препараты) и противогрибковый препарат нистатин.

Раствор нистатина приготовляется в кипящем спирте (1:1).
 

Трипсин, версен.

Трипсин и версен применяются для дезагрегации монослоя при пересеве клеточной культуры или для выделения клеток из тканей при получении первичных культур.

При пересеве обычно используют раствор трипсин - версена в соотношении 1:1. Этот готовый раствор поставляется фирмой-производителем.