Рост миобластов в культуре

Через 3 - 4 суток после первого посева, вырастает плотный монослой клеток.  Процесс образования монослоя можно пронаблюдать в инвертированный микроскоп.

Клетки, достигшие состояния монослоя, нуждаются в пересеве.

Этот процесс можно разделить на следующие этапы:
трипсинизация и рассев клеток.

Рассмотрим эти этапы более подробно.

Трипсинизация.

Перед началом работы необходимо проверить правильность расположения посуды и инструментов на столе ламинара (см. занятие1).

Обработать резиновые пробки всех сосудов с растворами горящей ватой, смоченной в спирте.
 

А - горелка (спиртовка) Б - емкость для слива В - бутыль с трипсин-версеном Г- чистая посуда (сосуд Карреля) Д - сосуд Карреля с клеточным монослоем Е - керамический стакан с инструментами: пинцеты, скальпель и т.д. Ж - керамический колпачок на спиртовку З - емкость со спиртом И - вата К - пенал со стеклянными пипетками Л - резиновая груша со шлангом

Процесс трипсинизации включает следующие стадии (показаны стрелками):

1. Открывание емкости с трипсином и помещение туда стеклянной пипетки.
2. Слив среды из сосуда Карреля с клетками в пустой чистый стакан (емкость для слива).
3. Добавление трипсина в сосуд с клетками (раствор трипсина должен покрывать  поверхность субстрата с клетками).
4. Удаление трипсина из сосуда с клетками в емкость для слива.
5. Повторное добавление такого же объема трипсина в сосуд Карреля.

Сосуд Карреля помещается в термостат на 10 - 15 мин. при температуре 37^оС для трипсинизации.

Сосуды Карреля необходимо время от времени слегка встряхивать для обеспечения равномерности протекания процесса.
 

О ходе трипсинизации можно судить по степени прозрачности раствора трипсин - версена. Открепляясь от поверхности посуды, клетки выходят в раствор. При этом наблюдается его замутнение (1).

Рассев суспензии клеток.

Перед началом второго этапа - рассева суспензии клеток - сосуды Карреля маркируются: на сосуде, в котором был монослой, ставится знак "+", а на сосуде, где не было монослоя (или на новых сосудах) ставится знак "-".

Необходимо убедиться в том, что на рабочем столе нет ничего лишнего, проверить правильность расположения посуды и инструментов на столе ламинара. Еще раз обработать резиновые пробки всех сосудов с растворами горящей ватой, смоченной в спирте.
 

А - горелка (спиртовка) Б - бутыль с питательной средой В - сосуд Карреля с суспензией клеток в трипсине ("+") Г - новый сосуд Карреля ("-") Д - емкость со спиртом Е - керамический стакан с инструментами: пинцеты, скальпель и т.д. Ж - керамический колпачок на спиртовку З - вата И - пенал со стеклянными пипетками К - резиновая груша со шлангом

Процесс рассева включает следующие стадии (показаны стрелками):
 

1. Открывание емкости с    питательной средой и помещение туда стеклянной  пипетки.

2. Перенесение определенного количества питательной среды в сосуды Карреля со знаком "+".

3. Рассев клеточной суспензии из сосудов с "+" в сосуды с "-".

- А как рассчитать необходимое количество среды, вносимое в сосуды Карреля со знаком "+"? - Уместный вопрос. Например, в сосуде с "+" Вы имеете монослой (это примерно 1,2 млн. клеток в мл). Вы решили рассеять монослой пополам. Предположим, что Ваш сосуд Карреля имеет полезный объем около 10 мл. Учтем, что новый сосуд, в который Вам надо пересеять часть клеток, тоже имеет объем 10 мл. Поэтому в суспензию с трипсином (сосуд "+") мы наливаем 20 мл среды, чтобы затем 10 мл клеточной суспензии перенести в сосуд Карреля со знаком "-", а остальные 10 мл оставить в "старом" сосуде.

 

Итак, после того, как все сосуды со знаком "+" залиты рассчитанным количеством среды, можно приступать к рассеву клеточной суспензии в новые сосуды.
	Стеклянная пипетка погружается в сосуд со знаком "+". Клеточная суспензия набирается в пипетку (приблизительно до половины ее высоты) и с силой выпускается обратно в сосуд. Эта операция проделывается несколько раз для того, чтобы дезагрегировать клеточные кластеры и обеспечить в дальнейшем равномерный рассев клеток и прикрепление их к субстрату.
Затем половина объема среды (в нашем примере 10мл) из сосуда Карреля с суспензией переносится в новый сосуд. Сосуды Карреля и бутыль со средой закрываются над пламенем горелки. Пересев клеток закончен.