В процессе пересева после трипсинизации Вы можете оценить состояние клеточной культуры, т. е. подсчитать общее количество клеток, а также выявить в их числе мертвые и живые клетки.

Для этих целей существует простой метод подсчета клеток в гемоцитометре (камере Горяева).

Подготовка гемоцитометра.

В клеточную суспензию добавляют равный объем 0,1%-ного трипанового синего. Этот краситель окрашивает только мертвые клетки. Шлифованное покровное стекло притирают к предметному стеклу гемоцитометра (белая стрелка) до появления колец Ньютона,  так, чтобы покрыть заштрихованные области (голубая стрелка).

Это приводит к образованию камеры с фиксированным объемом, поскольку края предметного стекла подняты над заштрихованной поверхностью ровно на 0,1 мм.

Каждая заштрихованная область состоит из 9 больших квадратов размером 1х1, т. е. объем, ограниченный каждым большим квадратом, оказывается равным 1мм х 1мм х 0,1 мм = 0,1 мм3. Отбирают часть окрашенной суспензии пастеровской пипеткой и заполняют счетную камеру гемоцитометра, используя капиллярное всасывание, не переполняя каналы камер.

Подсчет живых клеток в гемоцитометре (по R.L.P. Adams)
 

Подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей.  Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничиваю-щих линий. Поскольку объем большого квадрата составляет 0,1 мм3, то, умножив усредненное значение числа клеток в одном квадрате на 104, получают количество клеток в 1 мл суспензии.

Пример.

Сосчитайте клетки под объективом  x10.  Счет клеток проводите в четырех наборах из шестнадцати маленьких квадратов (в каждом углу центральной заштрихованной области). Считайте только неокрашенные клетки. Разделив полученное число на 4, получите среднее число клеток на 1 мм2. Поскольку высота камеры составляет 0,1 мм, то пересчетный коэффициент для гемоцитометра равен 104. Предположим, что полученное значение составляет 20 клеток на 1 мм2. Тогда 20х104 равно числу клеток в 1 мл окрашен-ной трипановым синим суспензии, а 2х20х104 равно числу клеток в 1 мл исходной суспензии, т. е. концентрация живых клеток в исходной суспензии составляет 4х105 клеток в 1 мл.

Одним из преимуществ клеточной культуры перед другими объектами исследования является возможность продолжительного наблюдения за жизнедеятельностью клеток, за состоянием отдельных клеточных органелл,  за процессами, идущими в клетках, фиксировать состояние культуры с учетом количественных и качественных параметров. Для  этих целей могут применяться методы микроскопии клеток (как прижизненной, так и после фиксации) и фотографирование.        Первая фотография клетки, полученная под электронным микроскопом, была сделана в 1945 году Кейтом Р. Портером, Альбером Клодом и Эрнестом Ф. Фулламом.

Чаще всего перед наблюдением в микроскоп клетки окрашивают.

Сравните две фотографии клеточного монослоя, полученные в нашей лаборатории  (линия СПЭВ).
Трудно поверить, что на них одна и та же культура. Дело в том, что клетки покрашены разными красителями.

краситель метиленовый фиолетовый

краситель индиго

Индиго <контрастирует> ядра клеток, а метиленовый фиолетовый структуры клетки.

Также существуют методы избирательного окрашивания структурных компонентов клетки. Приведем несколько примеров.
 

Окрашенные митохондрии в культивируемых фибробластах (краситель Родамин123. Флюорисцентная микрография. Douglas Wallace, Emory University, Atlanta) Окрашенный эндоплазматический ретикулум. Флюорисцентная микрография культивируемой клетки млекопитающего, окрашенной с помощью антител, связывающихся с белками в ЭПР. Hugh Pelham Клетка млекопитающего. Соответствие в клеточной локализации между митохондриями (слева; краситель Родамин123: прижизненное окрашивание, световая микроскопия) и микротрубочками (справа; иммунофлюорисцентная микрография после фиксации; клетка окрашена флюорисцентными антителами к микротрубочкам. Lan Bo Chen).   Зафиксированная окрашенная (Кумасси синий) клетка. Избирательное окрашивание белков цитоскелета. Colin Smith. Фибробласт. Микротрубочки (зеленый цвет; окрашены антителами к тубулину) в интерфазе. Ядро (сине-зеленый цвет) окрашено флуоресцентным красителем к ДНК. Nancy L. Kedersha.

Существуют методы прижизненного окрашивания клеток с целью различить мертвые и живые клетки. Некоторые фирмы для этих целей выпускают специальные наборы.

Например, такие тесты предлагает фирма Molecular Probes Europe BV.
 

PtK2 клетки, окрашенные с использованием LIVE/ DEAD EukoLight Viability Kit, при этом мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а живые - в зеленый.

Клетки бычьей спермы, окрашенные с использованием LIVE/DEAD FertiLight Sherm Viability Kit. Живые клетки зеленого цвета.