Потребности в питательных веществах.

В конце 40-х - начале 50-х годов большая часть клеток выращивалась в плазме или на фибриногеновом сгустке в присутствии тканевых экстрактов.

В своей классической работе Игл (Eagle) исследовал потребность этих клеточных линий в питательных веществах.

Ему удалось добиться размножения клеток в среде определенного состава, содержащей смесь аминокислот, витаминов, солей и углеводов, а также небольшое количество сыворотки лошади и человека.

При этом 27 факторов среды были определены как незаменимые для роста. Они составили основу питательной среды, известной как базальная среда Игла (БСИ).

Из 20 аминокислот, входящих в композицию, 13 оказались незаменимыми, а остальные могли быть синтезированы из других источников углерода. Удаление любого из 7 витаминов приводило к развитию симптомов витаминной недостаточности.

При культивировании клеток в БСИ среду необходимо было обновлять, и поэтому эта среда была вскоре заменена на Минимальную среду Игла (МСИ), в которой концентрация различных веществ была повышена, что обеспечивало непрерывный рост клеток в культуре в течение нескольких суток без смены среды.
 

Большинство клеток млекопитающих могут расти только будучи прикреплёнными к субстрату - к другим клеткам, к коллагену, к стеклу или к пластику.

Прикрепление клетки к субстрату

Очень популярным субстратом при изучении закономерностей роста клеток в зависимости от прикрепления к субстрату является желатин (денатурированный коллаген).

Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро дегенерируют. Для решений одних задач использование клеток, прикрепляющихся к субстрату, оказывается предпочтительнее, но для других целей лучше использовать клеточные суспензии.

Было показано, что если L-клетки поддерживать во вращающемся флаконе при скорости вращения 40 оборотов/ мин, то такие клетки не прикрепляются к поверхности, а добавление в культуру метилцеллюлозы до концентрации 0,1% предотвращает агрегацию клеток и поддерживает их жизнеспособность. Удаление двухвалентных ионов и увеличение концентрации фосфата благоприятствует росту клеток в суспензии.
 

Клеточный цикл и цикл роста.

Растущие клетки регулярно делятся примерно один раз в каждые 24 часа.
 

Животные клетки в культуре в процессе деления

Обратимся к кривой клеточного роста.
 

Кривая роста клеток в культуре

При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то культура находится на стадии экспоненциального роста (2). Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или же в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой они растут. Скорость роста при этом замедляется, и количество клеток в культуре достигает насыщения (конечная плотность клеток). Когда дальнейшие деления клеток прекращаются, наступает стационарная фаза роста культуры (3).

При восстановлении в культуре лимитирующего фактора клетки возвращаются в фазу G1 клеточного цикла, происходит синтез ДНК, после чего клетка делится. Есть несколько теорий, объясняющих такой тип контроля роста, но все они исходят из предположения, что контроль осуществляется на каком-то этапе, расположенном вскоре после деления. После прохождения этого этапа клетки включаются в клеточный цикл и делятся. Большая часть клеток у животных находится под такой формой контроля роста, что они прекращают продвижение по клеточному циклу, вскоре после митоза. Следовательно, для стимуляции первичной культуры, прежде чем клетки возобновят движение по циклу к фазе деления, следует устранить ограничение роста. Клетки некоторых быстрорастущих опухолей утрачивают чувствительность к контролю роста, и поэтому полученные из опухолей первичные клетки легко адаптируются к росту в культуре и могут расти до более высокой плотности по сравнению с клетками из нормальных тканей.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение. В большинстве случаев достижение плотного монослоя сопровождаются прекращением клеточных делений. Нормальные клетки могут в течение некоторого времени полностью сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии. Конечная плотность клеток зависит от концентрации сыворотки в среде и площади поверхности прикрепления. Было показано, что добавление сыворотки к контактно-заторможенной культуре индуцирует синтез ДНК, и клетки возобновляют деление.

По мере роста клеточного монослоя происходят следующие изменения:

1. клетки становятся более скученными и менее распластанными, что приводит к уменьшению доли клеточной поверхности, обращённой к среде;
2. среда истощается по питательным и другим компонентам, особенно в зоне, непосредственно примыкающей к клеткам.

Если из плотного монослоя нетрансформированных клеток удалить часть пласта, то в клетках, примыкающих к краю такой "раны", происходит стимуляция синтеза ДНК и делений. В результате клетки быстро занимают поверхность "раны" в монослое.
 

Возобновление клеточных делений после нанесния раны клеточному монослою

Из сыворотки, входящей в состав питательной среды, было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение. Ослабленным контактным торможением характеризуются раковые клетки,
 

Раковые клетки продолжают расти и после того, как заполнят всю поверхность субстрата, образуя мультислой.

Микрофотография (сканирующий электронный микроскоп) клеток линии А431: эпидермальная карцинома человека. Стрелками показаны места "наползания" клеток друг на друга

а также клетки, трансформированные вирусами.
 

Клетки, трансформированные in vitro ретровирусом (саркома Рауса), несущим температурочувствительную мутацию в онкогене. Округленная форма трансформированных клеток (34оС) Те же клетки приобретают нормальную морфологию, когда продукт онкогена инактивируется повышением температуры (39оС)

Считается, что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки в отличие от нетрансформированных продолжают расти вплоть до истощения среды.

Некоторые аномалии, часто наблюдаемые при трансформации нормальных культивируемых клеток опухолеродными вирусами:
1. Аномалии, связанные с изменением плазматической мембраны:
    - Усиление транспорта метаболитов;
    - Усиление образования пузырей на плазматической мембране.
2. Аномалии прикрепления:
    - Уменьшение адгезии к твердым поверхностям, как следствие - сохранение округлой формы;
    - Неспособность актиновых филаментов к образованию больших пучков.

Клеточная культура и адгезия.

Ведущую роль в межклеточном узнавании и клеточной адгезии играют поверхностные гликопротеиды клеточной мембраны.

Главным гликопротеидом клеточной поверхности является фибронектин.

Этот белок известен также под названиями:

cig ( Cold insoluble globulin- нерастворимый на холоду глобулин) и
CSP (Cell surface protein - клеточный поверхностный белок),
a2-SB (surface binding protein - поверхностный связывающий протеин),
белок LETS (large, external, transformation-sensitive - большой, внешний, чувствительный к трансформации белок).

Фибронектин характеризуется молекулярной массой 220 000, но может существовать также в форме связанных дисульфидными связями димеров и более высоких олигомеров;
 

Структура димера фибронектина: Участки связывания с: 1 - коллагеном, 2 - клеткой, 3 - гепарином.

этот белок обнаруживается в сыворотке и на поверхности нормальных клеток.

Фибронектин отсутствует на поверхности митотических клеток, и его количество резко увеличивается при достижении нормальными клетками полного монослоя, или при остановке клеточной пролиферации при низкой концентрации сыворотки.

Добавление фибронектина к трансформированным клеткам приводит к частичной нормализации клеточного фенотипа, что выражается в увеличении адгезии клеток друг к другу и к субстрату.

По-видимому, фибронектин является одним из факторов сыворотки, облегчающих прикрепление клеток и их распластывание на поверхности культуральной посуды.

Фибронектин нельзя относить к интегральным мембранным белкам, поскольку он может быть удалён с клеточной поверхности при обработке клеток 1 М мочевиной и невысокими концентрациями трипсина.

Молекулы фибронектина весьма гибки и состоят из нескольких, лабильно связанных доменов. На клеточной поверхности фибронектин образует относительно неподвижную фибриллярную сеть, связанную через мембрану клетки с элементами цитоскелета.

Межклеточная адгезия происходит в три этапа:

1) начальное соединение клеток, не требующее энергии.

2) спустя 2 мин при 37^оС между клетками образуется связь, разрушающаяся 0,01%-ным трипсином. Эта связь образуется только между клетками, но не между клетками и субстратом.

3) спустя 8 мин при 37^оС образуются более стабильные связи.

Клеточная линия - культура однородных клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками.

Ограниченные клеточные линии живут определённоё количество пассажей, а потом культура отмирает.

Ограниченная клеточная линия может также "трансформироваться " и превращаться в постоянную клеточную линию.

Пока неясно, возникают стволовые клетки постоянной культуры в ходе пассирования или они предсуществуют в замаскированной форме в популяции клеток ограниченной линии.

Также можно предположить мутационную природу их появления (хромосомные перестройки, траслокации, частичное или полное неспаривание или точечные мутации).

Перерождение клеток характеризуется следующими особенностями:

1. морфологическими изменениями (мельчание или укрупнение, уменьшение адгезивной способности, увеличение ядра);
2. укорочением клеточного цикла (время удвоения уменьшается до 12 часов, обычно 36 - 48);
3. уменьшением зависимости клеток от добавления сыворотки;
4. нетребовательностью к качеству субстрата;
5. увеличением потенции к образованию опухолей.

СВОЙСТВА   <ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ >  КЛЕТОК

+ - Большая скорость роста Высокая плотность клеточной культуры Способность расти в суспензии Повышенная хромосомная нестабильность Отклонение от фенотипа

Утрата специфических тканевых маркёров